中华风湿病学杂志2007年4月第11卷第4期chin J Rheumatol, April 2007,vol 11, No.4
葡萄糖-6-磷酸异构酶mRNA在RA患者
外周血单个核细胞中的表达及意义
赵冠飞 李永哲 宋玉国 胡朝军 佟大伟 张蜀澜
[摘要] 目的 探讨葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase, GPI) mRNA在类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达及其与RA疾病活动性的关系。方法 对30例RA活动期患者、30例RA缓解期患者、30例其他风湿性疾病患者及30名健康体检者。采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）半定量检测PBMCs中GPI mRNA的表达水平。结果 RA活动期患者GPI mRNA的表达水平明显高于RA缓解期患者、其他风湿性疾病患者及正常对照组（P<0.05），在RA活动组和RA缓解组，差异亦有统计学意义（P<0.05）。结论 GPI mRNA在部分RA患者中高表达，其可能在RA发病机制中起作用，并与疾病的活动性相关。
[关键词] 关节炎，类风湿，聚合酶链反应，葡萄糖-6-磷酸异构酶
The expression and significance of glucose-6-phosphate isomerase mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with rheumatoid arthritis ZHAO Guan-fei*, LI Yong-zhe, SONG Yu-gao, HU Chao-jun, TONG Da-wei, ZHANG Shu-lan. *Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China.
Corresponding author: LI Yong-zhe, Tel: 010-65295416, Email: Yongzhelipumch@yahoo.com.cn
[Abstract] Objective To investigate the mRNA level of glucose-6-phosphate isomerase (GPI) expression in patients with rheumatoid arthritis(RA). Method Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to semiquantitatively analyze GPI mRNA expression in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 30 active RA patients, 30 stable RA patients, 30 patients with other rheumatic disease and 30 healthy subjects. Results These was statistically significant different between patients with RA and other rheumatic disease (P<0.05). The expression was also significantly different between active RA and stable RA (P<0.05). Conclusion The increased expression of GPI mRNA may play a pathological role in the development of RA, and it may be correlated with the activity of RA.
[Key wards] Arthritis, Rheumatoid; Polymerase chain reaction, Glucose -6-phosphate isomerase
葡萄糖-6-磷酸异构酶（glucose-6-phsophate isomerase, GPI）最早在1968年因非球形红细胞溶血性贫血而得到认识，是糖酵解和糖异生的重要酶类，它除了具有酶活性之外还有细胞因子及生长因子活性。GPI作为一种泛在表达的抗原，在T细胞受体转基因小鼠（K/BxN）中，可诱导小鼠关节炎的发生，并持续产生抗GPI抗体[1，2]。文献[3，4]报道该抗体本身可能并不是类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）的标记性抗体，但血清及关节液中明显增高的GPI抗原本身可能与RA相关。本文通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）半定量检测外周血单个核细胞（PBMCs）中GPI mRNA的表达情况，从而进一步了解GPI抗原在RA发病中的作用及与RA疾病活动性的关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料
90例均来自2005年11月至2006年6月间北京协和医院门诊或住院患者，其中RA患者60例，包括活动期30例，其中男性9例，女性21例，年龄29-58岁，平均（43±14）岁；缓解期30例，其中男性7例，女性23例，年龄31-60岁，平均（47±17）岁。对照组30例为其他风湿病患者，包括系统性红斑狼疮（SLE）10例，骨关节炎（OA）7例，强直性脊柱炎8例，干燥综合征（SS）5例，其中男性9例，女性21例，年龄22-53岁，平均（40±11）岁。所有患者均符合1987年美国风湿病协会（ACR）诊断标准。另外30名来自健康体检者，其中男性12名，女性18名，年龄28-60岁，平均（48±12）岁。
1.2RA患者活动性判断标准
①3个或3个以上关节肿胀；②每日>45min的晨僵；③红细胞沉降率（ESR，魏氏法）>128mm/1h；④3个或3个以上的关节压痛；⑤双手平均握力（每只手各测3次，将单手最高值相加除以2为所得值）男性≤192mm Hg，女性≤146mm Hg。满足以上5项指标中的3项或3项以上者被认为不活动，不能满足其中的3项或3项以上者，被认为活动度较低。
1.3 方法
1.3.1 PBMCs的分离：收集研究对象清晨空腹肝素抗凝血3ml，用分层液密度梯度离心法常规分离PBMCs。
1.3.2 RNA的提取：取出PBMCs，经加入Trizol (Invotrogen)，离心；加等体积异丙醇，离心；加75%乙醇，离心；在空气中半干燥，溶于20ul焦碳酸二乙酯（DEPC）水中，-70℃保存备用。
1.3.3 RNA纯度和含量的测定：取5ul上样抽提的RNA样品电泳，在1.2%普通琼脂糖凝胶图谱中显示28S、18S两条带，28S带亮度为18S带亮度2倍者入选。紫外分光光度计检测RNA在260、280nm波长处的吸光度（A）值，并计算A260/A280比值和RNA浓度（A260×40×稀释倍数）。见图1。（略）
1.3.4 eDNA的合成：cDNA合成采用反转录试剂盒（Promega产品）。20ul反转录反应体系中包括RNA模板4ul，25mmol/L，MgCl2 2ul，10mmol/L dNTP 2ul，反转录缓冲液2ul，0.1mmol/L，Oligo (dT)1ul，反转录酶0.75ul (200U)，RNA酶抑制剂0.75ul （200U），DEPC水7.5ul。主要流程为在RNA中加入1ul Oligo（dT）。70℃孵育10min后加入反转录酶体系中其他试剂。反应条件为：42℃ 15min，95℃ 5min，4℃ 5min。反转录的cDNA -20℃保存或直接PCR扩增。
1.3.5 PCR扩增：反应总体积为25ul，包括模板cDNA 2.5ul、TaqDNA聚合酶0.5ul、上游引物1ul、下游引物1ul（上海生物工程公司合成）、dNTP 0.5ul、MgCl2 2.0ul、10×反应缓冲液2.5ul和双蒸水15ul。反应条件为：95℃预变性5min，94℃45s变性，52℃ 45s退火，72℃45s延伸，共35个循环，末轮循环72℃延伸10min。
1.3.6 RT-PCR产物的检测：取5ul PCR产物置于2%琼脂糖凝胶中90mV，电泳25min观察。电泳后凝胶置于紫外光可见分析装置中，用Gel Doc 2000 Bin-Bad公司（美国）图像分析系统进行扫描拍照，并检测各电泳条带的A值，计算GPI/β-actin从而得到GPI的相对含量。1.4 统计学处理
采用SPSS11.0软件，先对原始资料进行正态性检验，服从正态性分布用完全随机设计的方差分析。
2结果
2.1RNA纯度检测结果：A260/A280比值均在1.651-1.928，提示RNA纯度较高。RNA浓度在330-1700ug/ml。
2.2 GPI mRNA与RA疾病的相关性分析：各组GPI mRNA表达水平见表1。RA活动期患者GPI mRNA水平高于缓解期患者，差异有统计学意义（P<0.05）；RA缓解期患者GPI mRNA水平高于其他风湿病组及健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；其他风湿病组GPI mRNA水平与正常对照组差异无统计学意义（P=0.112）。
表1 各组PBMCs中GPI mRNA表达水平(x±S)
|
组别 |
例数 |
平均年龄 |
GPI/β-actin |
|
RA 活动期 |
30 |
43±14 |
2.28±0.36 |
|
缓解期 |
30 |
47±17 |
1.02±0.14 |
|
其他风湿病组 |
30 |
40±11 |
0.28±0.12 |
|
正常对照组 |
30 |
48±12 |
0.24±0.08 |
2.3 RA活动期患者，RA缓解期患者及健康对照者GPI mRNA的PCR产物电泳图：见图2，3（略）。以肌动蛋白（β-actin）为内参照，引物序列为：β-actin(上游)5’-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3’，（下游）5’-CTA-GAAGCATTTGCGGTGG-3’ 扩增产物320bp。GPI：（上游）5’-ACGCTGCTGCCACATAAGGT-3’，（下游）5’-AGCGTCGTGAGAGGTCACTTG-3’，扩增产物为240bp。
3 讨论
RA是一种以慢性、对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病，关节滑膜炎症是其主要病理改变，四肢关节是最易受侵犯的部位。其慢性炎症不只限于关节及关节周围组织，还可发生于心、肺、血管等器官和组织，因此是一种全身性疾病。疾病的晚期由于关节强直、畸形以致功能严重受损，是一种能致残的严重危害人们健康的疾病，而目前的诊断尚缺乏特异、敏感的血清学标志。
GPI是一种多功能蛋白，基因位于第19号染色体，全长约40kb，有18个外显子和17个内含子，在细胞内是糖酵解及糖异生的关键酶，在细胞外则有细胞因子的活性。GPI存在于细胞质，但可作为细胞因子或生长因子分泌于细胞外，具有多种生理功能。GPI早在1968年由非球形红细胞溶血性贫血的患者中发现，1986年，Gurney等在小鼠体内发现相对分子质量为56 000的神经白介质素（neurorenvin,NLK）能使体外培养的胚胎脊柱神经元存活。1988年又发现GPI与NLK有90%的同源性，将NLK的DNA转染到猴的COS细胞内，表达的产物显示出GPI的酶活性。Yu等[5]在肿瘤细胞内发现GPI可以调节基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3,MMP-3），而MMP-3在RA患者的滑膜细胞和血管内皮细胞中有高表达，有明显促进骨破坏的作用，能促进淋巴细胞的增殖。由此研究人员推测GPI的细胞因子及生长因子活性可能对RA患者的血管增生、滑膜增殖和骨破坏起了重要作用。同时增加了RA的易感性。采用激光共聚焦显微镜和免疫组织化学发现：GPI和抗GPI抗体形成的免疫复合物在患者关节和滑膜表面、滑膜动脉、毛细血管内皮细胞壁沉积，通过Fc受体介导或替代途径激活补体诱导关节炎症，介导炎细胞向关节局部浸润。
2001年Schaller等[6]发现小鼠的炎症与人RA相似，会持续产生抗GPI抗体。2002年，Schubert等[7]在RA患者的血清、关节液中检测到高浓度GPI抗体，而在正常人、SS病、Cyme关节炎中则浓度很低。2003年Matsumoto等[8]研究发现，抗GPI抗体在RA患者的阳性率很低，平均只有15%，而在牛皮癣关节炎组阳性率高。2003年Herve等[9]在RA患者中没有检测到抗GPI抗体，但在RA患者的血清和关节液中，却检测到了高浓度的GPI抗原。分别将抗GPI抗体阳性和阴性的人单个核细胞的cDNA进行克隆和测序，发现：有39个新的GPI变异体（57-1596bp），抗GPI抗体阳性正常人GPI变异体出现的频率为31.5%，抗GPI抗体阴性者仅为6.4%。抗GPI抗体阳性的RA患者变异体频率为28.6%，阴性者仅为1.6%，由此认为，GPI变异体是产生GPI自身抗体的关键[10]。
K/BxN小鼠（NDO小鼠与小牛胰腺核糖核酸酶特异的T细胞受体转基因小鼠F1）可自发性发展多关节炎症，与人类RA相似。进一步的研究证实：这个转基因T细胞受体（TCR）可以识别GPI自身抗体。关节炎K/BxN小鼠抗GPI抗体与外周关节结合，与II型胶原诱导的关节炎惊人的相似。GPI自身反应性B细胞主要位于关节的引流淋巴结，表明GPI的免疫识别是关节特异的。用重组人GPI免疫DBA/I小鼠，可以诱导急性关节炎；免疫C3H小鼠诱导慢性活动性关节炎；免疫C57BL小鼠仅诱导出轻度的关节炎，各种小鼠均产生显著的抗GPI抗体，并由此认为，GPI可以诱导慢性关节炎，该作用具有主要组织相容性复合体（MHC）和B细胞依赖性[11]。GPI能改变滑膜细胞或淋巴细胞的基因表达及性能，活化B淋巴细胞，激活T淋巴细胞及臣噬细胞，并最终导致自身免疫。
抗GPI抗体可能对RA的诊断无帮助，但RA患者血清和关节液中明显增高的GPI可能对RA的诊断有帮助，或才成为RA患者病情活动的指标之一。本实验通过RT-PCR方法检测RA患者PBMCs GPI mRNA的浓度，发现RA患者组的GPI mRNA表达量显著高于其他风湿病组及健康对照组（P<0.05），而RA活动组和RA缓解组差异也有统计学意义（P<0.05），并发现GPI mRNA表达量和RA疼痛和肿胀关节数呈正相关。GPI在部分RA患者中的高表达有一定特异性，而且和关节的炎症状态有一定相关性。GPI对RA的诊断及活动性的判断有很大的临床应用价值，有可能成为类风湿因子（RF）和抗环瓜氨酸多肽（CCP）抗体以外的一种标志物，或者和C反应蛋白（CRP）一样，成为RA活动的指标之一，从而增强RA诊断的敏感性和可靠性，很期望广泛应用于RA的诊断及活动性的判断，但需要进一步扩大样本和疾病的检测范围。
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(收稿日期：2006-10-25)
（本文编辑：董海原）
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30471617）
作者单位：100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院检验科（赵冠飞、李永哲、胡朝军、佟大伟、张蜀澜）；北华大学医学院临床免疫室（宋玉国）
通讯作者：李永哲，电话：010-65295416，Email：yongzhelipumch@yahoo.com.cn
