赵冠飞,齐福华,王清涛,翟玉华,孙卫红,刘金英. 实时荧光定量PCR与ELISA联合测定

类风湿关节炎患者GPI表达水平的研究.临床检验及实验室设备,2007,9(4) :14-17

实时荧光定量PCR与ELISA联合测定

类风湿关节炎患者GPI表达水平的研究

首都医科大学附属北京朝阳医院检验科     赵冠飞  齐福华  王清涛  翟玉华  孙卫红  刘金英

摘要:目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)mRNA及血清中GPI抗原表达与RA发病机制及活动性的关系,并比较GPI、抗突变型瓜氨酸波形蛋白(MCV)抗体、抗环瓜氨酸多肽（CCP）抗体、类风湿因子（RF）在RA中的诊断价值及相关性。方法 采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）方法检测60例RA患者（活动期28例、缓解期32例）、其他风湿性疾病患者30例（疾病对照组）、健康体检者30例（正常对照组）PBMCs中GPIm-RNA的表达水平和含量,以ΔCt=Ct(待测基因)-Ct(内参基因)来比较基因表达水平;同时用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组别血清中GPI,并同时检测抗MCV抗体,抗CCP抗体,RF的表达情况.结果 RA患者GPI表达水平明显高于其他风湿性疾病患者及正常对照组(P<0.05),活动期RA患者GPI表达水平与缓解期RA患者也有统计学差异(P<0.05);GPI对RA诊断的敏感性和特异性分别为68%,95%.结论 GPI可能参与了RA的发病过程,并与疾病的活动期相关,血清中GPI与抗MCV抗体,抗CCP抗体,RF均有相关性,可作为临床诊断RA的辅助指标.

关键词:葡萄糖-6-磷酸异构酶;类风湿关节炎;逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应;酶联免疫吸附试验

类风湿关节炎是(rheumatoid arthritis,RA)是一种具有较高发病率的致畸性自身免疫性疾病,早期诊断一直是国内外学者关注的热点,目前RA的诊断主要依靠临床症状和血清学指标,类风湿因子(RF)是最常用的检测项目,但特异性较差,不但在RA患者中出现,在其他结缔组织病及健康老年人中都可以检测到,这也限制了它的诊断作用.近年来研究发现的抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗体（AKA）、抗聚角度蛋白微丝抗体（AFA）、尤其是抗环瓜氨酸多肽（CCP）抗体^[1]对RA的早期诊断起到了积极的作用.但RA患者体内还存在多种自身抗原、自身抗体和其他生化指标的异常.近年有研究发现葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,GPI)抗原与RA相关,在RA患者血清和关节液中存在高滴度的可溶性GPI分子^[2].本研究通过荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RA患者GPI抗原的表达情况,并同时比对分析了RA患者血清中的其他相关自身抗体,以评估其在RA中的诊断价值.

资料和方法

1.临床资料

1.1研究对象:90例均来自2007年1月至2007年6月间北京协和医院门诊或住院患者,其中RA患者60例,包括活动期28例,其中男性9例,女性19例,年龄13-69岁,平均年龄(51±11)岁;疾病对照组30例,包括系统性红斑狼疮(SLE)12例,骨性关节炎(OA)5例,强直性脊柱炎(AS)8例,干燥综合征(SS)5例,其中男性13例,女性17例,年龄16-71岁,平均年龄(49±15)岁.所有RA患者均符合1987年美国风湿病协会(ACR)诊断分类标准.另外30名来自健康体检者,其中男性12例,女性18例,年龄35-62岁,平均(49±12)岁.

1.2RA患者活动性判断标准:①3个或3个以上关节肿;②每日>45min的晨僵;③血沉(ESR,魏氏法)>128rnm/1h;④3个或3个以上的关节压痛;⑤双手平均握力(每只手各测3次,将单手最高值相加除以2为所得值)男性≤192mmHg,女性≤146mmHg.判断活动期患者的标准为满足以上5项指标中的3项或3项以上者,不能满足其中的3项或3项以上者,被认为不活动或活动度较低.

2.实验方法

2.1主要仪器:Light Cycler荧光定量PCR扩增仪(Roche公司),Benchmark酶标仪(BIO-BAD公司,美国)

,Immage免疫比浊仪(Beckman Coulter公司,美国).

2.2主要试剂:淋巴细胞分离液(北京生化试剂公司),Trizol试剂(invitrogen公司),Superscipt II逆转录试剂盒(Promega,美国),荧光定量PCR反应所用试剂为SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa).GPI抗源检测试剂盒(上海北加生化试剂有限公司).

2.3PCR引物设计:根据Gene Bank中β-actin和GPI的基因序列设计引物用于荧光定量PCR检测,以肌动蛋白(β-actin)为内参照,引物序列为: β-actin(上游)5’-GCATGGAGTCCTGT-GGCAT-3’,(下游)5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3’,扩增产物113bP.GPI(上游)5’-A-CGCTGCTGCCA-CATAAGGT-3’,(下游)5’-AGCGTCGTGAGAGGT-CA CTTG-3’,扩增产物为107bP.(北京奥科生物技术有限责任公司合成)

2.4实验步骤

2.1.1FQ-RT-PCR方法检测GPImRNA:外周血单个核细胞(PBMCs)的制备:取患者及正常人EDTA抗凝静脉3ml,用淋巴细胞分离液(Ficoll)无菌分离出PBMCs,加入1ml Trizol(Invetrogen公司)后,-80℃保存用于RNA的制备;总RNA的提取:从-80℃冰箱中取出PBMCs,彻底混匀,室温静置5min;加入出境0.2ml氯仿,剧烈震动15s,室温静置2min,4℃ 12000g离心15min轻吸出上层水相至加一EP管,加等体积异丙醇,混匀静置10min;4℃ 12000g离心10min;弃上清,加入1ml75%乙醇洗涤沉淀, 4℃ 7500g离心5min;吸干乙醇,空气中干燥;加入20ul无RNA酶水溶解RNA.取5ul上样抽提的RNA样品电泳,在1.2%普通琼脂糖凝胶图谱中显示28S、18S两条带,且28S带亮度为18S带亮度二倍者入选.紫外分光光度计检测RNA在260nm、280nm波长处的吸光度值,并计算A260/A280比值;逆转录cDNA的合成:逆转录严格按试剂说明书操作,条件为42℃45min,95℃ 3min终止反应.20ul的反转录体系如下:RNA 10ul,5×Taqman RT Buffer 4ul,dNTP 1UL,oligo(Dt)1ul,0.1MDTT 2ul,RNAase Inhibitor 1ul,SuperScrip II 1ul.产物cDNA保存在-20℃备用;实时荧光定量PCR检测:将患者及正常人的cDNA在荧光定量PCR上检测,建立总体积为25ul的反应体系:2X Premix Ex Tag 12.5ul,上下游引物各0.5ul,Cdna  2ul,dH20 9.5ul.扩增反应条件为:95℃ 3min,95℃ 30sec,60℃退火30sec,72℃ 20sec,78℃ 1min,共35次循环;记录结果:每一标本以GPI基因和内参基因各重复两孔,以GPI基因两复孔检测Ct值的平均值减去内参基因两复孔检测Ct值的平均值的差值作评价GPI基因表达水平的指标,同时做空白孔对照,质控监测,以保证实验结果的准确性.

2.4.2ELISA检测血清中GPI浓度(该试剂盒和GPI抗原标准品均由上海北加生化试剂有限公司提供),实验步骤按照试剂盒说明书,酶标仪490nm读板,参比波长630nm.实验结果根据标准品浓度和吸光度作直线回归.

3统计学分析

采用SPSS11.0软件进行统计学分析,计量资料用X±S表示,多组资料之间比较用方差分析,两组之间比较采用t检验;GPI在各组间浓度采用非齐性方差分析,GPI与RA其他相关自身抗体相关性经Kendall’s Tau-b检验计算相关系数.

结果

1.FQ-RT-PCR方法检测结果

1.1细胞总RNA抽提结果:RNA纯度和含量的测定:取5ul上样抽提的RNA样品电泳,在1.2%普通琼脂糖凝胶图谱中显示28S、18S两条带,28S带亮度为18S带亮度二倍者入选.紫外分光光度计检测RNA在260nm、280nm波长处的吸光度值,并计算A260/A280比值和RNA浓度(浓度ug/mL=A260×40×稀释倍数).

1.2RT-PCR扩增目的的基因:取5ug总RNA进行逆转录,用逆转录反应产物5ul进行PCR扩增,经2%琼脂糖凝胶电泳可见清晰的扩大增条带(图1略),与目的基因片段GPI(107bp)大小相符.

1.3PCR扩增产物的特异性:利用β-actin及GPI的定量PCR反应的产物进行了熔解曲线及循环数测定,结果如(图2、图3略)所示,溶解曲线出现两个明显的主峰,无杂峰,非特异扩增产物及引物二聚体极少.

1.4实时荧光定量PCR检测结果:GPI mRNA在各组RA患者,疾病对照组,健康对照组中的表达,以GPI基因两复孔检测Ct值的平均值减去内参基因两复孔检测Ct值的平均值的差值作为该标本在单个核细胞上的GPI mRNA的表达的结果.

由表1可见活动期RA患者中在单个核细胞上的GPI的表达水平高于缓解期RA组、疾病对照组和正常对照组.通过单因素方差分析,RA患者外周血单个核细胞GPI的表达水平显著高于疾病对照组和正常对照组,统计学检验有显著性差异(P<0.05);RA活动期与RA缓解组GPI的表达水平统计学检验也有显著性差异(P<0.05).

2ELISA检测结果

2.1各组GPI浓度:RA患者GPI平均浓度为2.38±4.11ug/mL;疾病对照组为0.16±0.12ug/mL;正常对照组为0.15±0.13ug/mL.以0.33ug/mL为临界值,RA患者GPI阳性率为68%,疾病对照组为17%,正常对照组为8%.RA患者血清中GPI浓度显著高于其他组(P<0.05);RA活动组与缓解组GPI浓度也有统计学差异(P<0.05),GPI敏感性和特异性分别为68%和95%,见表2略.

2.2GPI与抗MCV抗体、抗CCP抗体、RF的相关分析:以上四种相关指标的检测结果经Kendall’s Tau-b检验并计算相关系数,结果显示,GPI与抗MCV抗体,抗CCP抗体,及RF均有相关性,见表3略.

2.3GPI、抗MCV抗体、抗CCP抗体、RF及两两联合检测的敏感性及特异性分析:对60份RA患者血清同时做以上四种指标的敏感性及特异性比对,结果显著,GPI与RF或抗CCP抗体与RF联合检测对RA诊断有相对较高特异性.见表4略.

讨论

RA是一种抗原驱动及T细胞介导的全身性自身免疫病,实验室的诊断对于疾病早期鉴别诊断,了解病情的发生、发展、治疗及判断预后均有重要的价值,是阻止病性发展和减少致残率的关键,RF虽敏感性较高,但在很多其他疾病也可出现阳性,2000年,有研究报道抗CCP抗体有很高的特异性^[3],在一定程度上弥补了RF诊断的不足,使RA的敏感性和特异性有所提高.近年有研究发现GPI与RA相关^[4,5],有可能成为RA实验诊断的新标志物.

GPI是一种多功能蛋白,分子量60KD,存在于细胞浆和细胞外液,由T细胞分泌,是糖醇解和糖异生的重要酶类.GPI具有多种免疫学活性,其一是细胞因子和生长因子活性,活性占70%,可诱导骨髓样干细胞向单核细胞及B细胞向浆细胞的分化.Schaller等^[2]在T细胞受体转基因小鼠模型(K/BxN)中发现,GPI作为一种自身抗原可诱导B细胞产生抗GPI自身抗体,并能诱导机体其他免疫细胞产生细胞因子引起关节炎症,同时作为一种自身抗原与抗GPI自身抗体结合,形成免疫复合物,沉淀在滑膜的滑膜动脉和毛细血管内皮细胞壁,通过Fc受体介导和替代途径,使补体激活,介导炎性细胞向关节局部迁移,引起关节炎症的进一步加重^[6].Kassahn等^[7]在RA患者的血清和关节液中发现高浓度的GPI及其免疫复合物,通过共聚焦显微镜和免疫组化发现RA患者的肥大滑膜或滑膜绒毛的小动脉和毛细血管有高密度的GPI表达,可能是由血管内皮生长因子(VEGF)所引起,并认为GPI是通过内皮细胞或者滑膜液中的可溶性蛋白递呈给免疫系统,在RA病理过程中起重要作用.Muraki等^[8]分别对抗GPI抗体阳性、阴性的RA患者及正常人进行了GPI-DNA序列分析,发现抗GPI抗体阳性的个体中GPI异构体的数量显著高于抗GPI抗体阴性者,并由此推测可能由于GPI的变异被机体识别,并刺激机体产生自身抗体,继而引发或加重RA.RA作为一种免疫功能紊乱所引起的自身免疫性疾病,患者体内存在多种自身抗原和自身抗体,不同患者自身抗原可能不同.

本研究结果显示,通过FQ-RT-PCR方法从mRNA水平相对定量检测RA患者外周血单个核细胞中GPI表达情况,同时采用ELISA方法进一步定量测定RA患者血清中GPI的浓度表达,结果显示两种方法检测结果一致,即RA患者组的GPImRNA表达量显著高于疾病对照组及健康对照组(P<0.05),而RA活动组和RA缓解组也有统计学差异(P<0.05),计算得出其特异性和敏感性分别为95%和68%.并同时检测了抗MCV抗体、抗CCP抗体、RF,将GPI与上述三种抗体作相关分析发现,GPI含量和抗MCV抗体,抗CCP抗体及RF均有相关.本实验同时对以上四种实验室指标分别作两两联合检测比较分析,发现GPI与RF或抗CCP抗体与RF联合检测可有效提高RA诊断的特异性.GPI在RA患者中的高表达有一定特异性,而且和关节的炎症状态有一定相关性,对RA的早期诊断及活动性的判断有很大的临床应用价值,有可能成为抗CCP抗体以外的一种标志物,或者和CRP一样,成为RA活动的指标之一,从而增强RA诊断的特异性和可靠性,很有希望广泛应用于RA的早期诊断及活动性的判断.

参考文献

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